在微生物学实验中，稀释涂布平板法是一种常用的定量分析方法，用于估算样品中的活菌数。该方法的核心在于通过一系列的梯度稀释，将原始样本中的微生物分散到适宜浓度，并在固体培养基上进行涂布培养，最终根据形成的菌落数来推算原始样本中的菌数。
然而，许多学生在学习这一方法时，常常对其中的计算公式感到困惑。本文将从基础原理出发，详细推导稀释涂布平板法中常用的菌落计数公式，帮助读者更好地理解其背后的逻辑与数学依据。
一、基本概念与操作流程
稀释涂布平板法的基本步骤如下：
1. 取样与稀释：从待测样本中取出一定量的液体，按比例进行多次稀释，得到不同稀释度的样品。
2. 涂布培养：将每个稀释度的样品分别涂布于固体培养基表面，经过适当时间的培养后，形成可见的菌落。
3. 计数与计算：选择菌落数在30~300之间的平板进行计数，利用稀释倍数和涂布体积等参数，计算出原始样本中的菌数。
二、关键参数定义
在进行计算之前，我们需要明确以下关键参数：
- $ N $：原始样本中的菌数（单位：CFU/mL 或 CFU/g）
- $ C $：所选平板上的菌落数
- $ D $：稀释倍数（即稀释后的体积与原液体积的比值）
- $ V $：涂布到平板上的液体体积（单位：mL）
三、公式推导过程
假设我们从原始样本中取了 $ x $ mL 的液体，然后进行了 $ n $ 次稀释，每次稀释的倍数为 $ d_1, d_2, \ldots, d_n $，那么总的稀释倍数为：
$$
D = d_1 \times d_2 \times \cdots \times d_n
$$
接下来，我们从稀释后的样品中取了 $ V $ mL 进行涂布。由于稀释后的溶液中菌数已减少，因此实际涂布的菌数为：
$$
\text{涂布菌数} = \frac{x}{D} \times \text{原始菌数}
$$
但为了简化计算，通常采用的是“稀释因子”法。即：若某次稀释后的样品中含有的菌数为 $ C' $，则原始样本中的菌数应为：
$$
N = C' \times D
$$
而实际上，我们是通过涂布 $ V $ mL 稀释液，得到 $ C $ 个菌落。因此，可以表示为：
$$
C = \left( \frac{N}{V} \right) \times \frac{V}{D}
$$
进一步整理得：
$$
N = \frac{C \times D}{V}
$$
这就是稀释涂布平板法中最常见的计算公式：
$$
N = \frac{C \times D}{V}
$$
四、举例说明
假设某样品经过10倍稀释后，取0.1 mL涂布于平板，培养后得到85个菌落。求原始样品中的菌数。
- $ C = 85 $
- $ D = 10 $
- $ V = 0.1 $
代入公式：
$$
N = \frac{85 \times 10}{0.1} = 8500 \, \text{CFU/mL}
$$
五、注意事项
1. 菌落数范围：选择菌落数在30~300之间的平板，以保证数据的准确性。
2. 重复实验：建议对同一稀释度进行多次涂布，取平均值以减少误差。
3. 稀释倍数合理：避免因稀释不当导致菌落数过少或过多，影响计算结果。
六、总结
稀释涂布平板法的计算公式虽简单，但其背后蕴含着严谨的数学逻辑。通过对稀释倍数、涂布体积和菌落数的合理组合，可以准确地估算出原始样本中的活菌数量。掌握这一公式的推导过程，不仅有助于实验操作，也能提升对微生物定量分析的理解深度。
希望本文能为学习微生物实验的学生提供清晰的思路和实用的参考。
